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月旭煉金術士教您如何選擇緩沖鹽

更新時間:2021-02-22 點擊次數:2217

 

各位小伙伴在做方法開發時,緩沖鹽是經常會使用到的一類試劑,那么小伙伴們對緩沖鹽了解多少呢,我們該如何選擇合適的緩沖鹽呢,這里就讓小編給各位小伙伴們講解一二。

 

 

什么時候需要緩沖鹽?


在反相色譜分析中,流動相的pH值一般在2-7之間,當分析物在反相條件下可解離,或樣品的pH值在2-7之外時,就需要緩沖鹽,在反相條件下可解離的化合物一般有氨基和羧基,他們的pKa在1-11之間,選擇正確的緩沖液pH值可保證解離的官能團處于一種形式,離子形式或中性化合物的形式;如果樣品的pH值對柱子有傷害,則緩沖溶液可使其變溫和或減小其危害,常規硅膠基質色譜柱的pH耐受范圍2-8。

 

常見緩沖鹽分類


堿類


堿類添加劑常見的是氨水和三乙胺,兩者都能讓水的pH到達非常高的水平,高到能把硅膠顆粒溶解掉,要慎用,另外就是這兩種溶劑通常不太容易通過沖洗維護的方式清除掉。尤其是三乙胺,即使是色譜純,放的久了也可能會由于變質導致污染。


酸類


甲酸:通常使用的濃度在1%以下,能夠讓水的pH達到二點幾的級別。


乙酸:酸性比甲酸略弱,通常使用濃度不超過5%,能夠使水的pH到達到二點幾的級別。

三fu乙酸:比較強的酸,使用濃度通常不超過0.5%,能使水的pH達到2以下,具有很大的離子強度及一定的離子對作用,是分析蛋白/多肽時常用的添加劑。以上三種酸z致命的問題在于低波長下的紫外吸收,通常不建議在小于215nm波長的情況下使用,另外就是甲酸/乙酸還有比較大的揮發性,時間久了濃度會發生變化。

磷酸:這是一種不具有揮發性的酸,離子強度也不錯,重要的是,它在低波長紫外區無本底吸收,但是它也存在不少缺點,比如不能兼容質譜方法。

除此之外,還有一些其他的酸,比如硫酸,鹽酸或者檸檬酸,但是都是非常罕見。

 

鹽類

 

相比單純的酸堿,根據不同緩沖鹽中兩種鹽的配比,可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液,具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動相的pH值。


甲酸鹽:通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨,這類鹽的溶解度好,*兼容液質聯用的方法,對色譜柱的傷害也比較小,但是缺點是離子強度比較低。另外就是甲酸鹽比較容易潮解,稱量的時候比較困難,在流動相里還可能揮發。

與甲酸配合,可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系,大概緩沖能力在pH3~4.5的范圍之內,只要調節兩者濃度的比例即可。

乙酸鹽:常見為乙酸銨。在使用上,和甲酸鹽十分類似,離子強度也不高,與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4~5.5左右。

磷酸鹽:是HPLC在紫外檢測條件下常用的緩沖液之一,因為它可以在低于220 nm的波長下使用。磷酸鹽具有三個pKa值,可提供pH 1.1-3.1,6.2-8.2,11.3-13.3三個緩沖范圍。雖然它使用廣泛,但是也要注意它的溶解度問題,防止高濃度條件下在HPLC泵或者色譜柱中析出。

常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽,二者對pH的控制能力十分接近,只是離子強度稍有差異,絕大多數情況下是可以互換使用的,磷酸由于是多元酸,能夠形成一氫鹽和二氫鹽,所以使用磷酸緩沖體系調節pH也是組合比較多,跨度比較大的,并且可以提供較高的離子強度,可惜,磷酸鹽流動相體系無法兼容質譜。

 

以磷酸鈉鹽為例,可以有以下兩種組合的緩沖體系:


磷酸-磷酸二氫鈉:pH可以達到1.2~3.1左右的范圍。
磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉:pH可以達到6.5~8左右的范圍。

 

 

通過樣品的pka值選擇合適緩沖鹽


pH 變化會對不同結構化合物的色譜行為產生不同的影響。中性化合物在反相色譜系統的保留與pH 無關;

酸性化合物在pH 趨于酸性(pH 變小,尤其低于化合物的pka 值)時會因狀態趨于中性而增加保留;

堿性化合物在pH 趨于堿性(pH 變大,尤其高于化合物的pka 值)時會因狀態趨于中性而增加保留。

反之,高pH 時酸性化合物保留降低;低pH時堿性物質保留會降低。若想獲得穩定的保留,對于酸性待測物而言,流動相的pH 值-好低于待測物pka值兩個單位;對于堿性待測物來說,流動相的pH值--好高于待測物pka值兩個單位。


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