考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量

考馬斯藍染色法又稱Bradford法，是Bradford于1976年建立起來的一種蛋白質(zhì)濃度的測定方法。考馬斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質(zhì)結合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。

分析天平、燒杯、玻璃杯、移液槍、紫外分光光度計或酶標儀。

①標準蛋白溶液：常用牛血清蛋白（BSA），配制1mg/mL的標準溶液。

②0.01%考馬斯亮藍染色液G-250：稱取0.01g考馬斯亮藍G-250，溶于95%乙醇中，加85%(m/V)的磷酸10mL，最后用超純水定容至100mL，裝入棕色瓶中保存。（不宜久存，室溫1-2個月）

紫外分光光度計測定

將表格所示溶液加入試管中充分混勻，10min后倒入比色皿，放入紫外分光光度計于595nm測定吸光值，1號管作為空白對照，以蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標曲作為定量依據(jù)。

②樣品測定

取含10-100μL蛋白質(zhì)溶液于小試管中，加水稀釋至0.1mL，然后加入5mL G-250蛋白染色液，充分混勻，10min后倒入比色皿，放入紫外分光光度計于595nm測定吸光值，1號管作為空白對照，將測得吸光值帶入標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

酶標儀測定

將表格所示溶液依次加入酶標板中混勻，靜置10min后，放入酶標儀中于595nm測定吸光值，A孔作為空白對照，以蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標曲作為定量依據(jù)。

②樣品測定

取含4-40μL蛋白質(zhì)溶液于酶標板中，加水稀釋至40μL，然后加入250μL G-250蛋白染色液，充分混勻，靜置10min后，放入酶標儀于595nm測定吸光值，A孔作為空白對照，將測得吸光值帶入標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

①通常會將樣品稀釋多個梯度進行測定，防止樣品測得吸光值過高，超出標曲導致的含量計算偏差。

②樣品中若含有去污劑，如TritonX-100、SDS等，會嚴重干擾測定結果。

③比色反應需在1h內(nèi)完成，如果測定要求很嚴格，可以在染色液加入后的5-20min內(nèi)測定吸光值，因為在這段時間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。

④測定時，蛋白-染料復合物會有少部分吸附在比色皿杯壁上，測試完后可用乙醇溶液將比色皿中的殘留物沖洗掉，再用超純水沖洗干凈保存。